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谷氨酸脱氢酶(GDH)活性检测试剂盒(微量法)
谷氨酸脱氢酶(GDH)活性检测试剂盒(微量法)图片
包装: 100管/96样
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产品介绍

GDH(EC 1.4.1.2)广泛分布于植物中,和谷氨酸合成酶(GOGAT)共同参与谷氨酸的合成,在氨同化和转化成有机氮化合物的代谢中起重要作用。

GDH催化NH4+、α-酮戊二酸和NADH,生成谷氨酸和NAD+,引起340nm吸光度下降。通过测定340nm吸光度的下降速率,计算GDH活性。

注意:实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

产品组成:

试剂名称规格保存条件
提取液液体100ml×1瓶2-8℃
试剂一液体20ml×1瓶2-8℃
试剂二粉剂×1瓶-20℃

溶液的配制:

工作液的配制:在试剂二中加入19ml试剂一充分溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min。

试验中所需的仪器和试剂:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤 (仅供参考) :

一、样本处理(可适当调整待测样本量,具体比例可以参考文献)

1.收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照每 500万细菌或细胞加入 1ml提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3秒,间隔 10秒,重复 30次);8000g 4℃离心 10分钟,取上清,置冰上待测。

2.称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10分钟,取上清,置冰上待测。

二、测定步骤

1.紫外分光光度计/酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2.样本测定:

在微量石英比色皿或 96孔 UV板中加入 10μL样本和 190μL工作液,混匀,立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 5min 20s后的吸光值 A2,计算ΔA=A1-A2。

三、GOGAT 活性计算

a.按微量石英比色皿计算

1.按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=643×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算:

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=643×ΔA÷W

3.按细菌或细胞数量计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(U/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=1.286×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm; V样:加入样本体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol =109nmol。

b.按 96 UV 板计算:

1.按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(U/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V样)÷T=1072×ΔA÷Cpr

2.按样本质量计算

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(U/g质量)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×W)÷T=1072×ΔA÷W

3.按细菌或细胞数量计算

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1nmol NADH定义为一个酶活力单位。

GDH(U/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样÷V样总×500)÷T=2.144×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:96孔板光径,0.6cm; V样:加入样本体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,5min;Cpr:样本蛋白质浓度, mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万;109:单位换算系数,1mol=109nmol。

注意事项:

1.当ΔA大于 0.5时,将样本进行稀释后测量。

2.由于提取液中含有一定浓度的蛋白(约 1mg/ml),所以在测定样本蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。

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