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液相色谱出现“双峰”原因
2021.08.20   点击587次

HPLC分析中,在色谱柱正常,样品浓度适宜,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下,峰型应对称而尖锐。但在实际操作中,如果对样品不了解,前处理不恰当或者分析方法不合理等,会出现峰形不正常的情况,其中双峰现象就是液相色谱中常见的问题之一。色谱双峰指的是一种物质,但在色谱图中出现双峰。那么,出现双峰的原因主要有哪些呢?

出现色谱双峰的原因一般有以下几种原因:色谱柱堵塞或污染、溶剂极性、进样量不合适、样品特性、pH值和仪器参数设置不合理。

1、色谱柱堵塞或污染

如果在样品分析时发现每个色谱峰都有双峰出现,尤其在采用单一纯物质时,则可以确定是色谱柱出现问题了,一般是柱头受损或者柱头固定相污染引起的。

如果进样量少,原来色谱柱正常,色谱峰的形状多为一大峰带一小峰,不一定拖尾,这一般应是柱头受堵,将色谱柱反过来接,用流动相冲洗或酸洗或其它溶剂,将堵在柱头的残留物冲掉,再反过来,一般情况下就行了。当然不反冲,正冲有时也会正常的。

如果峰拖尾,双峰强弱相差不大,柱头固定相变脏或流失可能性更大,这时可以将进样头拧开,将微孔滤片超声,柱头刮去一部分填料,重新填上新填料拧紧,不过这个对技术要求较高且不能经常做,否则用不了几次,色谱柱就会应柱效降低而报废。如果上述不能解决问题,可能是柱塌陷造成的,此时需要更换色谱柱。

2、溶剂极性

HPLC分析多为反相色谱,流动相多为甲醇、乙腈、水,加各种添加剂以改善分离性能。样品一般用与流动相相溶的溶剂溶解,最佳的溶解方法是用流动相溶解。在实际分析中,有时候为了样品的溶解性或稳定性加入了一点的缓冲液,缓冲液的酸碱性可能会导致样品转化,从而产生双峰现象。此时需要更换缓冲液,调整溶剂pH值,或者用流动相配置样品。

此外,样品要现配现用,避免样品溶解液的有机相比例、pH值发生变化而导致的溶剂效应。

3、进样量不合适

当用溶剂极性强度大的试剂,如纯甲醇、纯乙腈,纯乙醇,而分析体系中以水为主时,如果样品进样量大,如定量管为20ul,此时单一的纯物质会出现双峰,第二峰比第一峰小(每次都不太一样),且拖尾,保留时间会提前(相对进样量少而言),将进样量减少一半以上,峰型将变为正常。这是样品的溶剂与流动相极性相差太大,而流动相来不及将其稀释达到平衡造成的,此情况下需要减少进样量。

另一个原因是,进样量不一定大,但绝对量很大,色谱图上的双峰紧靠在一起,基本上齐高,不拖尾(如果出峰很快,也可能是色谱柱问题)。将样品稀释再进样就可以了,这是由于进样量过大,色谱柱过载造成的。

4、样品特性

有些样品由于其化学结构的特点,存在互变异构现象,而这种互变异构体无法分开,而是以一个动态平衡存在。在色谱分析时,在一个特定的条件下(如pH值、流动相极性、温度等),一种物质将出现双峰,双峰靠的很近,基本齐高,不拖尾,条件稍一变化,尤其pH,双峰现象将消失,如红霉素等。

有的样品紫外的色谱图上看不到双峰,但在LC-MS下,用质谱检测器,其质谱的总离子流图上较明显,如农药啶虫眯(吡虫清)。

5、pH值

pH值对色谱双峰的影响出现在各个环节上(前面已经提到),尤其在缓冲液流动相平衡过程中其影响更为明显。当连续进样时,受pH的连续变化影响会经常遇到这种双峰的情况。另外,在样品分析时,流动相的pH尽量远离被分析物的等电点,否则也容易引起双峰的产生。在用离子对试剂分析时,选择不好条件也会容易引起双峰的产生。

6、仪器参数设置不合理

参比波长设置错误,例如设置分析波长254nm,参比波长400nm,这个对于大多数化合物可能没影响。但是如果被测化合物,在400nm处也有强的紫外吸收,比254nm更高。这样其出峰时,由于背景的抵扣作用,本来一个峰会变成对称的二个峰,而且如果将二峰之间的峰谷反转180度,恰好是一个完整的峰。这时要将参比波长设置更大,或者取消。

HPLC分析中,在色谱柱正常,样品灵敏度足够,分析方法合适,色谱峰在出峰时间较短的条件下(不包括梯度),峰型应对称而尖锐。但是,在对样品了解程度不够,方法不当,样品处理方法及进样方式不合理情况下,会出现各种意想不到的问题,而对色谱峰难以作出合理的解释,尤其对于新手更是如此,所以,了解每种鬼峰出现的原因对我们的分析工作是非常重要的。

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