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Fd-谷氨酸合成酶(Fd-GOGAT)测试盒(微量法)
Fd-谷氨酸合成酶(Fd-GOGAT)测试盒(微量法)图片
货号: GOGAT-1-W
包装: 100管/48样
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货号:GOGAT-1-W
产品介绍

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

GOGAT 广泛分布于植物中,和谷氨酰胺合成酶共同构成 GS/GOGAT 循环,参与氨同化的调控。GOGAT 分为以 NADH 为还原剂的 NADH-GOGAT  和以铁氧还蛋白为还原剂的Fd-GOGAT。Fd-GOGAT  主要存在于叶绿体基质中,与光合作用和光呼吸有关,主要同化NO3- 还原和光呼吸产生的 NH4+

测定原理:

Fd-GOGAT 催化谷氨酰胺的氨基转移到 α-酮戊二酸,形成两分子的谷氨酸,谷氨酸脱氢酶催化谷氨酸的脱氢反应,同时产生 NADH,使 WST-8 显橙黄色,在 450 nm 下测定吸光值。

需自备的仪器和用品:

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 12mL 试剂六溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;

试剂二:液体 6mL×1瓶,4℃避光保存;

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 5mL 蒸馏水溶解待用,用不完的试剂 4℃保存;

试剂四:粉剂×1瓶,-20℃保存;临用前加入 20mL 试剂六溶解待用,用不完的试剂分装后-20℃保存;

试剂五:液体 3mL×1 瓶,4℃避光保存; 试剂六:液体 40mL×1 瓶,4℃保存;

粗酶液提取:

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 450nm。

2、 样本测定

在 EP 管中加入如下试剂

试剂名称(μL)测定管对照管
试剂一100100
试剂二5050
充分混匀,30℃保温 5min
样本5050
试剂三50

50
充分混匀,30℃准确反应 30min,95℃水浴 5min 终止反应,冷却后 10000g 4℃离心 5min,取上清液待测

3、 工作液配制

临用前按试剂四:试剂五=180:20(μL)的比例配制工作液,用多少配多少。

4、 谷氨酸含量测定

在 96 孔板中加入如下试剂

试剂名称(μL)测定管对照管
上清液2020
工作液180180

混匀,25℃反应 30min,450nm 下测定吸光值 A 测定与对照,△A=A 测定-A 对照,每个测定管设一个对照管。

Fd-GOGAT 活性计算:

标准曲线为 y = 2.2168x - 0.0005,R2 = 0.9996;其中 x 为标准品浓度 μmol/mL, y 为吸光值△A。

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。

Fd-GOGAT(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0005)÷ 2.2168×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T×1000=75.2×(ΔA+0.0005)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟产生 1 nmol 的谷氨酸定义为一个酶活力单位。

Fd-GOGAT(nmol/min/g  鲜重)=(ΔA+0.0005)÷ 2.2168×V 反总÷(W× V 样÷V 样总) ÷T×1000=75.2×(ΔA+0.0005)÷W

V 反总:反应体系总体积,0.25mL;ε:V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取 液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;1000,μmol 到 nmol 的换算系数。

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