试剂仪器设备原料
银牌会员第4
访问量: 616905   网址: hydranal.cnreagent.com    在线留言 
产品搜索
检测试剂盒 >> 生化试剂盒
NADH-谷氨酸合成酶(NADH-GOGAT)测试盒(微量法)
NADH-谷氨酸合成酶(NADH-GOGAT)测试盒(微量法)图片
货号: GOGAT-1-Y
包装: 100管/96样
索取资料及报价
货号:GOGAT-1-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

GOGAT 广泛分布于植物中,和谷氨酰胺合成酶共同构成 GS/GOGAT 循环,参与氨同化的调控。

测定原理:

GOGAT 催化谷氨酰胺的氨基转移到α-酮戊二酸,形成两分子的谷氨酸;同时 NADH 氧化生成 NAD+,340nm 吸光度的下降速率可以反映 GOGAT 活性大小。

需自备的仪器和用品: 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×2 瓶,4℃保存;

粗酶液提取:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)在试剂二中加入 9mL 试剂一充分溶解混匀,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物 种)水浴 5min;现配现用(配好后 3h 内用完);

(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μL 样本和 180μL 试剂二,混匀,立即记录 340nm处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

GOGAT 活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

GOGAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=321×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GOGAT(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GOGAT(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.642×ΔA V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总 数,500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

GOGAT(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GOGAT(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GOGAT(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.286×ΔA V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总 数,500 万。

相关产品
我要咨询 关闭
  •      
  • 姓名* 
  • 电话* 
  • 单位* 
  • email 
  • 留言内容*
  • 验证码*  
  • 让更多商家关注