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NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)测试盒(微量法)
NADPH-细胞色素C还原酶(NCR)测试盒(微量法)图片
货号: NCR-1-W
包装: 100管/96样
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货号:NCR-1-W
产品介绍

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶,在外源物质代谢中具有重要作用,尤其 是药物和毒物的代谢。NCR 作为 P450 酶系的重要一员,催化氧化型 P450 还原再生。

测定原理:

NCR 催化 NADPH 还原氧化型细胞色素 C,还原型细胞色素 C 在 550nm 处有特征吸收峰; 通过测定 550nm 吸光度的增加速率,来计算 NCR 活性。

自备仪器和用品:

普通离心机,超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:粉剂×2 瓶,4℃保存。临用前根据用量每瓶加 100mL 蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体×1 瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1 管,-20℃保存。临用前配制,加 1.04 mL 蒸馏水充分溶解,4℃保存。

试剂四:粉剂×1 管,4℃保存。临用前配制,加 1100 μL 蒸馏水充分溶解,4℃保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核和线粒体等:称约 0.5g 组织,加入 4℃预冷的 1 mL 试剂一,冰上充分研磨,10 000g 4℃离心 30min,取上清液,转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体:4℃,100 000g,离心 60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤 2 的沉淀中加 1 mL 试剂一,盖紧后充分震荡溶解,100 000g 离心 30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL,盖紧后充分震荡溶解,4℃保存待测。

NADPH-细胞色素 C 还原酶测定操作:

1.  分光光度计/酶标仪预热 30 min,调节波长到 550 nm,蒸馏水调零。

2.  试剂二在 37℃水浴中预热 30min。

3.  空白管:取微量石英比色皿/96 孔板,依次加入 10μL 蒸馏水、180μL 试剂二、10μL 试剂 三和 10μL 试剂四,迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化,第 10s 和第 130s 吸光 值。△A 空白管=A2-A1。

4.  测定管:取微量石英比色皿/96 孔板,依次加入 10μL 提取液、180μL 试剂二、10μL 试剂 三和 10μL 试剂四,迅速混匀后于 550nm 处测定 2min 内吸光值变化,第 10s 和第 130s 吸光 值。△A 测定管=A4-A3。

注意:空白管只需做一次。

NCR 活性计算公式公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 550×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中,每克组织每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活单 位。

NCR ((nmol/min/g  鲜重)= (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T=275×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε:还原型细胞色素 C 摩尔消光系数,19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm;d:比色皿光径(cm),1cm;V 反总:反应体系总体积(L),210μL=2.1×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL), 需要另外测定;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),10μL=0.01mL;V 样总:提取液 体积,0.5 mL;T:反应时间(min),2min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义:37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 C 为 1 个酶活 单位。

NCR ((nmol/min/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 1100×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义:37℃中,每克组织每分钟催化产生 1μmol 还原型细胞色素 c 为 1 个酶活单位。

NCR ((nmol/min/g  鲜重) = (△A 测定管-△A 空白管)÷(ε×d)×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)÷T= 550×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

ε:还原型细胞色素 C 摩尔消光系数,19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm;d:96 孔板光径(cm),

0.5cm;V 反总:反应体系总体积(L),210μL=2.1×10-4L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL), 需要另外测定;V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),10μL=0.01mL;V 样总:提取液 体积,0.5mL;T:反应时间(min),2min。

注意事项:

试剂三、试剂四临用前配制,配好未使用完的 4℃可保存两天。

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