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ADPG焦磷酸化酶(AGP)测试盒(微量法)
ADPG焦磷酸化酶(AGP)测试盒(微量法)图片
货号: AGP-1-Y
包装: 100管/96样
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货号:AGP-1-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中,催化葡萄糖-1-磷酸与 ATP 反应生成淀粉合成的直接前体 ADPG,是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。

测定原理

AGP 催化的逆向反应生成 G1P,在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成 6-磷酸葡萄糖酸和 NADPH,340nm 下测定 NADPH 增加速率,即可计算AGP 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 20mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存;临用前加入 9mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装 后-20℃保存,禁止反复冻融;

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存;临用前加入 4mL 蒸馏水充分溶解备用;用不完的试剂分装 后-20℃保存,禁止反复冻融;

粗酶液制备

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、试剂一置 30℃保温 10min 以上。

3、在 EP 管中按顺序加入下列试剂

试剂名称(μL)测定管
试剂一50
试剂二80
样本10

混匀,30℃保温 15 min,置沸水浴中 1 min(盖紧,防止水分散失),冰浴迅速冷却后,4000g 4℃ 离心 5min,取上清液,在 96 孔板中依次加入下列试剂

上清液80
试剂一85
试剂三35

混匀后,立即于 340 nm 波长下记录初始吸光度 A1 和 2min 后的吸光度 A2,计算ΔA=A2-A1。

AGP 活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T×稀释倍数=2813×ΔA÷W

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,2 min;稀释倍数:1.75;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下:

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活性单位。

AGP(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T×稀释倍数=5627×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

AGP(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T×稀释倍数=5627×ΔA÷W

V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d:

96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,2 min;稀释倍数:1.75;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量。

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