在实验操作过程中，需特别注意以下关键环节以确保数据的准确性和可重复性：

1. 样本处理标准化

组织匀浆或细胞裂解液制备时，需严格控制裂解时间(建议冰上操作不超过30分钟)和离心转速(12000×g，4℃)。过度裂解可能导致蛋白降解，而离心不彻底则易引入杂质，干扰后续吸光度检测。建议分装保存样本于-80℃，避免反复冻融。

2. 板孔加样技巧

使用多通道移液器时，需校准枪头与板孔的垂直角度，避免液体挂壁。每孔加样体积误差应控制在±2%以内，建议预先用PBS润洗枪头。若样本浓度过高，需用标准稀释液梯度稀释，不可直接使用裂解缓冲液，以防基质效应。

3. 温育条件优化

封闭步骤推荐使用5%脱脂牛奶(TBST配制)，室温1小时即可达到饱和结合。若背景值偏高，可尝试延长洗涤次数(5次×1分钟)或加入0.05% Tween-20增强去除非特异性吸附。酶标二抗孵育阶段需避光，震荡速度建议设为300 rpm以促进分子结合。

4. 显色终止时机

TMB显色液加入后，需密切监测孔板颜色变化。当标准品最高浓度孔呈现深蓝色(OD450≈2.0)时立即终止反应，避免强酸环境导致显色产物衰减。终止后10分钟内完成读数，延迟检测可能导致吸光度漂移。

5. 数据质控要点

每板必须包含空白孔(仅稀释液)、阴性对照(已知低表达样本)及复孔(CV＜15%)。标准曲线R²值低于0.98时需排查稀释误差或板间温度不均问题。建议使用四参数拟合算法处理非线性数据。

注：若出现异常值，建议复查样本保存条件或更换检测批次试剂。对于低丰度蛋白样本，可尝试延长一抗孵育时间至4℃过夜。*

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