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小鼠骨来源树突状细胞(BMDC)的培养步骤
2020.05.20   点击174次

小鼠骨来源树突状细胞(BMDC)的培养:

1.取小鼠股骨胫骨,小鼠要年轻!(6W-8W,以前用只年把的养出来外形也张牙舞爪,但流式检测没有CD11c表达,很奇怪啊;性别方面公母不限,经典版本说公的好,公的壮实,骨头大)

2.冲骨髓细胞,我冲出来的骨髓细胞永远没有文献上说的那样多,但不影响大局,我一次用两只,怕出意外少了细胞,论坛里有战友说不要混一起,我不知道具体原因,盼赐教

3. 细胞计数,不去红细胞!(不知是好是坏,文献说去红细胞会把一些祖细胞也去掉了)记数,计数只记白细胞(形态学区分,红细胞无核较小,目前我的眼睛目前还在为此积累经验),2×10e6(似乎太低,这套方案作者是架起式一皿养到第12天的,所以我个人觉得看你在哪天收细胞做下游实验,如果只养到第6天或者第8天,多点应该也行吧?)白细胞种100mm细菌培养皿(注意是细菌培养皿,说悬浮细胞还是用细菌皿好,还说抑制细胞贴壁,让更多祖细胞向树突细胞分化而不是巨噬细胞),这一天记为第0天

4.第3天加等体积(10ml)BMDC培养基

配方:每50ml含:1640基础培养基45ml, 5ml灭活胎牛血清,50ul 100×的beta巯基乙醇(一直不知道它的作用,请高手跳出来作答谢谢啊),500ul 100×的谷氨酸盐(谷氨酰胺?我现在用Gibco的Glutamax,说不会降解产生氨),1ug rmGM-CSF(Chemicon和PPT的都用过,现在用PPT,还行好像)

5.第6天,第8天半量换液,离心设置为300g,5min(不知道够不够,肯定有损失)

6.第10天300g,5min收集悬浮细胞转到细胞培养皿(巨噬细胞多贴点壁),同时培养基成分里rmGM-CSF含量至少减半(好像说怕继续分化成非树突吧,文献看了有一段时间记得不那么清楚了惭愧啊,其实文献仅供参考,也不一定对,关键还是自己的实践)

7.第11天加LPS刺激其成熟,普遍认为(也可能是我自己认为),第6天或第8天收不成熟DC会比较多,看实验需要,建议想要不成熟DC的朋友请在这两天收网)

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