1.原核表达概念

蛋白表达是指用模式生物如细菌、酵母、动物细胞或者植物细胞表达外源基因蛋白的一种分子生物学技术。原核蛋白表达是指通过基因克隆技术，将外源目的基因，通过构建表达载体并导入表达菌株的方法，使其在特定原核生物或细胞内表达。

2.原核蛋白表达系统优缺点

常见的蛋白表达系统有原核、酵母、昆虫、植物和哺乳动物表达系统，其中最经济最实惠的是原核蛋白表达系统，四种常见表达系统区别如下表1：

表1：常见蛋白表达系统区别

蛋白表达量：原核＞酵母＞哺乳，昆虫系统与原核和酵母接近，选择合适的蛋白表达系统还需要根据您的实验成本、周期等一系列因素综合考量，目前最常用的是原核蛋白表达系统，原核表达体系常用的宿主为大肠杆菌和枯草杆菌，前者表达量高，后期产品需要去除内毒素；后者蛋白产量相对较低，但不产生内毒素，主要区别如下图所示：

3.原核蛋白表达系统组成

一个完整的蛋白表达系统通常包括宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系。

3.1宿主菌

原核蛋白常见宿主菌系列为BL21（DE3）、Rosetta系列菌株。

3.2外源基因

由于外源基因具有多样性，高效表达外源基因须考虑优化密码子，提高外源基因 mRNA 的稳定性，优化载体设计等。

3.3表达载体

原核蛋白表达载体质粒包括复制子(Replicon)、启动子(promoter)、筛选标签(selection marker)、多克隆位点（MCS）和融合蛋白移除策略(fusion tag removal strategy)，常见的原核表达载体pET-28a（+）、pGEX-4T-1、pET SUMO，原核表达质粒载体如图所示：

3.4其他组成（融合标签）

蛋白重组表达过程中采用亲和标签融合表达有两方面的作用：一方面是为了使蛋白纯化过程变得更加容易；另一方面是为了促进某些不溶性蛋白可溶。融合标签选择可参考卡梅德官网列表。

4.原核蛋白表达系统应用方向

原核表达系统有非常良好的应用前景。根据查询相关公开信息显示，原核表达系统可以用于大规模生产重组蛋白，如药物、疫苗、抗体等，从而为生物医学领域提供了有力的支持，原核表达系统可以用于生产植物和动物的生长调节物质、抗菌肽、抗虫蛋白等，从而提高作物产量和品质，降低农药使用量，保障食品安全。同时，原核表达系统也可以用于生产工业酶、生物染料等，具有高效、低成本、环保等优点，为工业生产提供了新的途径。 

5.原核蛋白表达全流程介绍

原核蛋白表达大致实验流程图如下：

5.1优化密码子

大肠杆菌对密码子的使用频率不同，有最佳密码子，偏好密码子，一般选择使用频率大于20%的密码子。基因序列经过优化，能提高mRNA二级结构的稳定性，避免tRNA库数量不充足延迟/终止翻译，翻译移码和氨基酸错配等情况。

5.2目的基因合成

通过PCR方法，以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。

5.3表达载体构建

选择合适的载体，常见原核表达载体是pET系列、pGEX-4T-1、pET-SUMO等，将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳，PCR产物双酶切后回收。

5.4转化表达菌株

原核蛋白使用BL21（DE3）、Rosetta系列菌株，将质粒载体在连接酶作用下转化到RosseStta BL21菌株，通过涂布TB（含50ug/ml kana）平板筛选，挑取单克隆进行活化培养。

5.5蛋白表达鉴定

从TB平板中挑取单克隆活化培养至菌体OD600为0.6-0.8时，IPTG进行37℃诱导4h表达，取诱导表达前与诱导后各条件的菌体制样进行SDS-PAGE分析，诱导表达结果如图：

5.6蛋白放大表达与纯化

5.6.1放大表达

取能够表达目的蛋白的BL21菌株，接种到1L TB培养基，加入IPTG诱导12h，离心，收集菌泥，超声破碎后收集上清和沉淀，如下图放大诱导表达结果：

5.6.2纯化

上清纯化：过滤膜上Ni柱亲和富集纯化，SDS-PAGE分析。

包涵体（沉淀）纯化：缓冲液洗脱上Ni柱亲和富集纯化，SDS-PAGE分析，纯化结果如下图：

5.7交付

SDS-PAGE结果图片。