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亚硝酸还原酶(NiR)测试盒(微量法)
亚硝酸还原酶(NiR)测试盒(微量法)图片
货号: NIR-1-G
包装: 100管/48样
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货号:NIR-1-G
产品介绍

注意:正式测定之前选择 2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

硝酸还原酶(NiR)是一类能催化亚硝酸盐还原的酶,广泛存在于微生物及植物体内,是自然界氮循环过程中的关键酶,可以将亚硝酸盐降解为 NO或 NH3,从而减少环境中亚硝态氮的积累,降低因亚硝酸盐累积而造成的对生物体的毒害作用。

测定原理

亚硝酸还原酶可将 NO2-还原为 NO,使样品中参与重氮化反应生成紫红色化合物的 NO2-减少,即 540nm处吸光值的变化可反映亚硝酸还原酶的活性。

需自备的仪器和用品

天平、研钵、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、水浴锅、低温离心机。

试剂组成和配制

提取液:液体 112ml×1瓶,4℃保存。

试剂一:液体 4ml×1瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1瓶,4℃保存。临用前加 5ml蒸馏水溶解。

试剂三:液体 5ml×1瓶,4℃保存。(如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解)

试剂四:液体 10ml×1瓶,4℃避光保存。(如出现沉淀可以 70-80℃加热溶解)

试剂五:液体 10ml×1瓶,4℃避光保存。

工作液:临用前根据用量将试剂四和试剂五以 1:1的比例混合。

酶液提取

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液),进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议500万细胞加入 1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 10000g,4℃离心 10min,取上清置于冰上待测。

测定操作表


空白管对照管测定管
样本(μL)
2020
蒸馏水(μL)2040
试剂一(μL)40
40
试剂二(μL)404040
混匀后,25℃反应 1h
试剂三(μL)404040
充分震荡 30S
上清液(μL)707070
工作液(μL)140140140
充分混匀,立即测定 540nm下各管吸光值,分别记为 A空白管、A对照管、A测定管。空白管只要做一管,每个测定管需设一个对照管。

计算公式

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线:y = 1.3594x + 0.0072,R2 = 0.9997;x为标准品浓度(μmol/ml),y为吸光值(A标准管-A空白管)。

1.按照蛋白含量计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/mg prot)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(V样×Cpr)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每小时还原 1μmol NO2-的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/g鲜重)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(W ×V样÷V样总)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104个细胞每小时还原 1μmol NO ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/104 cell)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷1.3594×V标÷(细胞数量

×V样÷V样总)÷T = 1.47×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷细胞数量

V标:标准液体积,0.04ml;V样:体系中加入样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,1h; Cpr:样本蛋白含量;W:样本质量,g

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

标准曲线:y = 0.6797x + 0.0072,R2 = 0.9997;x为标准品浓度(μmol/ml),y为吸光值(A标准管-A空白管)。

1.按照蛋白含量计算

酶活单位定义:每毫克组织蛋白每小时还原 1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/mg prot)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(V样×Cpr)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷Cpr

2.按照样本质量计算

酶活单位定义:每克组织每小时还原 1μmol NO2-的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/g鲜重)=[A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(W×V样÷V样总)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷W

3.按照细胞数量计算

酶活单位定义:每 104个细胞每小时还原 1μmol NO2-的量为一个酶活力单位。

NiR(μmol/h/104 cell)= [A空白管-(A测定管-A对照管)-0.0072]÷0.6797×V标÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T = 2.94×(A空白管-A测定管+A对照管-0.0072)÷细胞数量

V标:标准液体积,0.04ml;V样:体系中加入样本体积,0.02ml;V样总:加入提取液体积,1ml;T:反应时间,1h; Cpr:样本蛋白含量;W:样本质量,g

注意事项

1.配制好的工作液 3天内使用完。

2.若吸光值超过 1.5,将上清液进行适当的稀释后再加入工作液显色,并在计算公式中乘以稀释倍数。

3.严格控制显色时间,否则会对结果有影响。

4.标准曲线线性范围为 0.03μmol/ml-1.5μmol/ml。

5.A空白管-(A测定管-A对照管)线性范围为 0.02-1.5。

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