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酰基转移酶(AAT)测试盒(微量法)
酰基转移酶(AAT)测试盒(微量法)图片
货号: AAT-1-W
包装: 100管/96样
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货号:AAT-1-W
产品介绍

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AAT是一个多功能蛋白大家族,主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应,在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理:

AAT催化乙酰 CoA转移乙酰基到丁醇,释放的 CoA还原 DTNB生成 TNB;TNB在 412nm有吸收峰,测定 412 nm吸光度增加速率可计算 AAT活性。

自备仪器和用品:

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、恒温水浴锅、无水乙醇。

试剂组成和配制:

提取液:液体 100ml×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 20ml×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存。

试剂三:粉剂×1支,4℃避光保存。

粗酶液提取:

1.组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心  10min,取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细胞加入 1ml提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声  3秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3.液体:直接检测。

AAT测定操作:

1、分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长到 412 nm,蒸馏水调零。

2、工作液的配制:临用前在试剂二瓶中加入 18ml试剂一,充分混匀待用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、试剂三的配制:临用前加无水乙醇 1ml充分溶解待用,用不完的试剂 4℃保存。

4、空白管:在 Ep管或 96孔板中加入 10μL 提取液和 180μL工作液,充分混匀,35℃反应15min,加入 10μL试剂三,充分混匀,25℃静置 10min,测定 412nm处吸光值,记为 A空白管。

5、测定管:在 Ep管或 96孔板中加入 10μL 样本和 180μL工作液,充分混匀,35℃反应15min,加入 10μL试剂三,充分混匀,25℃静置 10min,测定 412nm处吸光值,记为 A测定管。△A=A测定管- A空白管,空白管只要做一管。

AAT活性计算:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T = 98.04×△A÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 98.04×△A÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/104cell) = △A÷(ε×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T= 98.04×△A÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/ml) = △A÷( ε×d)×V反总÷V样÷T= 98.04×△A

ε:TNB消光系数,13600L/mol/cm;d:比色皿光径:1cm;V反总:反应总体积,0.2ml;

V样:加入反应体系中上清液体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:蛋白含量,mg/ml;W:样本质量,g;T:反应时间,15 min。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按照蛋白浓度计算

活性单位定义:每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d)×V反总÷(V样×Cpr)÷T=196.08×△A÷Cpr

(2)按照样本质量计算

活性单位定义:每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/g鲜重) = △A÷(ε×d)×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T= 196.08×△A÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/104cell) = △A÷(ε×d)×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=196.08×△A÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:每毫升样品每分钟催化产生 1nmol TNB定义为一个酶活单位。

AAT (nmol/min/ml) = △A÷(ε×d)×V反总÷V样÷T= 196.08×△A

ε:TNB消光系数,13600L/mol/cm;d:96孔板光径:0.5cm;V反总:反应总体积,0.2ml;

V样:加入反应体系中上清液体积,0.01ml;V样总:加入提取液体积,1ml;Cpr:蛋白含量,mg/ml;W:样本质量,g;T:反应时间,15min。

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