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线粒体呼吸链复合体Ⅰ/NADH-辅酶Q还原酶测试盒(微量法)
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货号: FHTA-1-Y
包装: 100管/96样
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货号:FHTA-1-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

复合体Ⅰ(EC 1.6.5. 3)又称 NADH-CoQ还原酶或 NADH脱氢酶,广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,是线粒体内膜中***蛋白复合物。该酶催化一对电子从 NADH传递给 CoQ,同时可使 O2还原生成 O2-,是呼吸电子传递链上产生 O2-的主要部位。测定该酶活性,不仅可以反映呼吸电子传递链(ETC)状态,而且可以反映活性氧(ROS)生成状态。

测定原理

复合体Ⅰ能够催化 NADH脱氢生成 NAD+,在 340nm下测定 NADH的氧化速率计算出该酶活性的大小。需自备的仪器和用品紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制

试剂一:液体 100ml×1瓶,-20℃保存;

试剂二:液体 20ml×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 1.5ml×1瓶,-20℃保存;

试剂四:液体 25ml×1瓶,-20℃保存;

试剂五:液体 1ml×1支,-20℃保存;

试剂六:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入 2ml蒸馏水;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

工作液的配制:临用前将试剂五转移到试剂四中混合溶解;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

①准确称取 0.1g组织或收集 500万细胞,加入 1ml试剂一和 10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

②将匀浆 600g,4℃离心 5min。

③弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

④上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅰ(此步可选做)。

⑤步骤④中的沉淀即为线粒体,加入 200uL试剂二和 2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10秒,重复 30次),用于复合体Ⅰ酶活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

(2)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、200μL工作液和 15μL试剂六,混匀,记录 340nm处初始吸光值 A1和 2min后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2

复合体Ⅰ活力单位的计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:

(1)按蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=1808×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体 Ⅰ活力 ( nmol/min/g鲜重 ) =[ΔA×V反总÷ ( ε×d )×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=365×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.73×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,0.202 ml; T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

b.使用 96孔板测定的计算公式如下:

(1)按蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=3616×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。复合体 Ⅰ活力 ( nmol/min/g鲜重 ) =[ΔA×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(W×  V样÷V样总 )

÷T=730×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

复合体Ⅰ活力(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=1.46×ΔA

V反总:反应体系总体积,2.25×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,0.202 ml;T:反应时间,2 min;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500万。

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