产品描述

Tofacitinib (CP-690550) Citrate是一种新型JAK抑制剂，对JAK3，JAK2，JAK1的IC50分别为1 nM, 20 nM 和112 nM。

靶点（IC50 & Targe）

JAK1,112nM

JAK2,20nM

JAK3,1nM

Lck,3.87μM

ROCK2,3.4μM

体外研究

CP-690550抑制IL-2调节的人T细胞爆发式增殖，和IL-15诱导的CD69表达，IC50分别为11和48 nM。CP-690550抑制混合淋巴细胞反应，IC50为87 nM。CPCP-690550 处理含人野生型或V617F JAK2的鼠因子依赖的细胞Patersen–促红细胞生成素受体(FDCP-EpoR) 细胞，抑制细胞增殖，IC50分别为2.1 µM 和0.25 µM。CP-690550 抑制白细胞介素-6诱导的STAT1 和STAT3磷酸化，IC50分别为23和77 nM。而且, CP-690550作用于携带JAK2V617F的小鼠 FDCP-EpoR细胞，具有显著的促凋亡作用,然而效果比作用于携带野生型JAK2的细胞低。伴随着抑制关键JAK2V617F依赖的下游信号效应器信号转导的磷酸化，及(STAT)3, STAT5, 和v-akt小鼠胸腺瘤病毒癌基因同源(AKT)的转录激活。[2] 此外, CP-690550 在体外作用于人猕猴 NK 和CD8+ T 细胞，抑制IL-15诱导的CD69表达。[3]

体内研究

CP-690550 作用于小鼠模型，降低迟发型超敏感反应和延长心脏移植存活。而且, CP-690550 处理来自JAK2V617F阳性 PV患者体内外膨胀的红系祖细胞，产生特定的抗增殖(IC50 = 0.2 µM) 和促凋亡活性。 相反, 在增殖(IC50 > 1.0 µM)和凋亡检测时，从健康对照组中的膨胀祖细胞对CP-690550敏感性低很多。 [2] CP-690550按 10和30 mg/kg剂量每天处理NK细胞，持续处理2周，与对照组相比，细胞数显著降低,这种作用存在时间依赖性。 CP-690550处理实验组的动物效应小样记忆CD8+ 细胞数比对照组低55% 。[3]

激酶实验

酶实验:

进行JAK1, JAK2, 和JAK3 激酶实验，使用在杆状病毒感染的 SF9细胞中表达的蛋白(GST 和人类JAK酶催化结构域的融合蛋白)，通过亲和层析在谷胱甘肽-琼脂糖凝胶中纯化。反应底物是聚谷氨酸-酪氨酸 PGT (4:1), 按100 μg/mL包被到Nunc Maxi Sorp板上，在 37oC下过夜。然后冲洗板三次, 在每孔中加入JAK 酶，孔中含100 μL激酶buffer(50 mM HEPES, pH 7.3, 125 mM NaCl, 24 mM MgCl2) + ATP + 1 mM 钒酸钠)。按不同剂量加入CP-690550，进行激酶实验。然后在室温下温育30分钟，再冲洗实验板三次。通过标准ELISA实验，使用 磷酸化抗体测定一个给定孔中的磷酸化的酪氨酸水平。

细胞实验

Cell lines: HEL细胞, 扩增的红系祖细胞

Concentrations: 0.1 μM,1 μM

Incubation Time: 40分钟

Method:HEL细胞, 从正常供着，两个PV病人体内获得的扩大红系祖细胞，和 FDCP-EpoR受体细胞(每组样本2 × 107 个细胞),使用浓度不断增高的 CP-690550处理, 然后在不同时间点收集。细胞制成颗粒，使用冷磷酸盐缓冲液冲洗三次，然后悬浮在300 µL裂解液中 ，再在冰上处理1小时。细胞裂解液按20 000g转速在 4oC下离心20分钟,取出上清液。在上清液中加入15 µL anti-JAK2 (处理细胞) 或 anti-JAK3 兔抗体(未处理细胞)，然后在冰上再处理1小时。最后, 在上清液中加入50 µL 蛋白A/G琼脂糖浆，然后在 4oC下不断旋转温育过夜。冲洗抗体-蛋白复合体三次, 再使用放射免疫沉淀法(RIPA) buffer冲洗一次,使用冲洗冲洗一次,最后使用50 mM Tris-HCl buffer pH 为7.5冲洗一次。通过 Western blotting 分析免疫沉淀复合物，使用磷酸酪氨酸抗体，除去，再使用anti-JAK2和anti-JAK3抗体做探针，来分析免疫沉淀复合物。

(Only for Reference)

动物实验

Animal Models: 毛里求斯成年猕猴

Formulation: 在溶于蒸馏水的0.5%甲基纤维素中配制

Dosages: 10, 30 mg/kg/d

Administration: 口服饲喂

(Only for Reference)

参考文献

[1] Flanagan ME, et al. J Med Chem, 2010, 53(24), 8468-8484.

[2] Manshouri T, et al. Cancer Sci, 2008, 99(6), 1265-1273.

[3] Conklyn M, et al. J Leukoc Biol, 2004, 76(6), 1248-1255.

[4] Changelian PS, et al. Science. 2003, 302(5646), 875-878.