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凯氏定氮法测定食品中蛋白质的操作要点及注意事项、常见问题汇总
2019.04.02   点击159次

蛋白质被认为是构成生物体细胞组织的重要成分。食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源,具有糖类和脂肪不可替代的作用。含氮量是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。在检验食品中蛋白质时,通常是先检定出食品中的总氮量,然后乘以蛋白质换算系数,以此得到蛋白质含量。凯氏定氮法由Kieldahl于1883年首先提出,至今仍被作为标准检验方法。凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定过程。

原理

向样品中加入浓硫酸和催化剂,充分混匀,然后加热消化分解,样中碳和氢被氧化成二氧化碳和水,其中的有机氮转化为硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量乘以换算系数,即为蛋白质的含量。

样品消化

浓硫酸具有脱水性和氧化性,可使有机物中的碳、氢被氧化为二氧化碳和水,蛋白质会分解为氨,然后氨与硫酸结合生成硫酸铵。通常加入硫酸钾和硫酸铜作为催化剂来加快蛋白质分解。硫酸钾可以提高溶液的沸点,一般情况下,纯硫酸的沸点在340℃左右,但是在添加硫酸钾后,可提高至400℃以上。提高温度使有机物加快分解。但是不能加入过多的硫酸钾,否则会因为温度过高,使生成的硫酸铵发生热分解成氨而造成损失。硫酸铜除作为催化剂外,还可以指示消化终点的到达,有机物全部消化完全后,溶液呈现清澈的蓝绿色,硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。

蒸馏

消化液中的硫酸铵在碱性环境下会转化成氨。为防止水中微量的氨气受热逸出,影响测定结果,所以水蒸气发生器中的水要保持酸性。硫酸铵是一种强酸弱碱盐,需要足够的碱液使结合态的氨完全反应并释放出来,这个过程中的氢氧化钠一定要过量,过量的氢氧化钠会与硫酸铜生成蓝色的氢氧化铜沉淀,氢氧化铜受热分解成黑色的氧化铜沉淀。检验蒸馏是否完成,可用奈氏试纸法,NH4+或NH3遇奈氏试剂会反应生成棕红色的碘化汞铵化合物。

吸收

加热蒸馏放出的氨可用硼酸溶液吸收,硼酸有吸收氨的作用,又因其呈微弱酸性,不影响下一步滴定时指示剂的变色反应。温度过高会使硼酸吸收液对氨的吸收作用减弱,从而造成损失,故一般不超过40℃。

滴定

待吸收完全后,用硫酸或者盐酸标准溶液进行酸碱滴定,滴定液的浓度直接影响结果的准确性,必须按照要求进行配制和标定。混合指示剂在中性溶液中呈灰色,滴定终点时液体呈灰色。

注意事项

① 所用的试剂溶液应用无氨蒸馏水配制;

② 取样应具有代表性,取样前将样品充分混匀;

③ 样品称量放入凯氏烧瓶时,切勿使样品粘附在瓶颈部,避免样品未消化完全而造成氮损失;

④ 为了保证使烧瓶壁上的残渣消化完全,在消化过程中要不时地转动凯氏烧瓶;

⑤ 消化脂肪或糖含量较高的样品时,易产生大量泡沫,为防止泡沫溢出,消化时应先消化加热并不断摇动,或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂;

⑥ 当样品消化液浑浊或未澄清透明时,可先将凯氏烧瓶放冷至室温后,再加入30%的过氧化氢,然后继续加热消化;

⑦ 加碱后,漏斗要进行水封,避免因装置漏气造成氨的逸出影响结果的准确性;

⑧ 要保证蒸馏装置不能漏气;

⑨ 在蒸馏时反应室与外界存在的压力差,蒸汽可将氨带出。故蒸馏时,要保证蒸汽均匀、充足,中间不能停止加热,防止发生倒吸;

⑩ 蒸馏前如果加碱后消化液呈蓝色而没有生成氢氧化铜沉淀,说明加入的碱量不足,需要适量补加碱;,蒸馏时为防止水蒸气发生器内液体爆沸,加入几片碎瓷片或大的玻璃珠,玻璃珠直径最好大于联通的玻璃管直径,以免玻璃珠进入玻璃管内影响蒸汽均匀、充足的输出;冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下,防止氨逸出,蒸馏完毕后先将冷凝管下端提离液面,再蒸1min后清洗管口,再移开吸收瓶,最后关掉热源,否则可能发生倒吸。

常见问题解答

1、凯氏定氮仪在蒸馏时翻滚剧烈,会对操作者构成危险吗?

答:一般不会,凯氏定氮仪在蒸馏时翻滚剧烈,是水蒸气大量进入消化管液体翻滚,并非剧烈反应造成;而且仪器有超压保护装置,可以保持管路内部常压,避免危险。

2、凯氏定氮仪工作中对水质有什么要求?

答:凯氏定氮仪的蒸馏水桶内要装蒸馏水或纯水,机器长期不用要将蒸馏器里水放掉。

3、凯氏定氮仪开机没声音是怎么回事?

答:凯氏定氮仪开机没声音,如果机器电源开关内红灯亮,说明是定氮仪内保险管烧断了,保险管位置在机器内部靠近电源开关接口5公分处黑色壳子内。

4、凯氏定氮仪开机后蒸馏器内不加水怎么解决?

答:开机半分钟后检查蒸馏水桶是否漏气,能被气充鼓是正常;检查蒸馏水桶内水位是否超过三分之一,不够补齐;检查蒸馏水桶的位置,低于放置仪器的台面,压力不够,加不上水;检查蒸馏水桶进气、进液管是否接错,接错桶内会产生气泡并发出声响;检查排水阀,应呈关闭状态。

5、凯氏定氮仪蒸锅不加热,不能产生蒸气,为什么?

答:如果机器能正常加碱,不能加热出蒸气,判定加热丝可能烧坏了,可拿万用表量一下加热丝正负极,不通可确定加热丝损坏,换新加热丝。

如果机器不能正常加碱,开机后又没有任何声音,判断是保险丝烧断了,保险管位置在机器内部靠近电源开关接口5公分处黑色壳子内。

6、凯氏定氮仪工作时声音大,是否正常?

答:属于正常现象,这是机器内部气泵工作的声音。

7、凯氏定氮仪工作中不能加碱、加碱没有声音,为什么?

答:检查碱桶是否漏气,被气充鼓机器才能正常工作;仪器使用时间过长,碱管内部会产生结晶,导致加液时流速降低,没有声音。

8、定氮仪在工作时,从顶部冒出类似烟的气体,怎么回事?

答:检查冷却水进水的水龙头是否打开,冷却水关闭或者水量小都会导致消化管出来的蒸气不能被冷凝,从机器里冒出来的水蒸气,看起来类似烟。

9、定氮仪使用中发现消化管进满水,怎么解决?

答:定氮仪使用中发生消化管进满水,是由于机器控制水位器导电性降低造成的,解决办法:打开水位器取出探针用砂纸打磨,去掉氧化层;在蒸馏水桶里加入3-5克实验室用氯化钠,摇匀溶解。

10、定氮仪使用中发生蒸馏器、水位器进满水,硼酸吸收液容器中进水,怎么解决?

答:是机器控制水位器导电性降低造成的,解决办法:打开水位器取出探针用砂纸打磨,去掉氧化层;在蒸馏水桶里加入3-5克实验室用氯化钠,摇匀溶解。

11、定氮仪使用中消化管中白色管子发生倒吸,怎样解决?

答:仪器停止工作(蒸馏器停止加热),气阀未能及时关闭,会产生倒吸现象,可在白色管子上扎一些小孔。气阀损坏,不能关闭,也会倒吸。

12、定氮仪工作中隔3-5秒钟会发出声响,是否正常?

答:这种声响属于正常现象,仪器工作状态下,蒸馏器会不断加热产生水蒸汽而消耗水,仪器会自动打开水阀进行补水,声响就是水阀打开、关闭的声音,属于正常现象。

注:

1、每次使用仪器前,应让仪器空煮一次,清洗仪器的内部管路。

2、仪器使用完毕,应将其中一只桶的桶盖打开,将桶内的气体排出,延长附件的使用寿命(3个或2个桶串联,排气时只打开一只桶盖即可)。

结语:凯氏定氮法经典、准确,适用于食品中蛋白质的测定。但是因样品中一般会含有一些非蛋白质的含氮化合物,所以凯氏定氮法测定结果为样品中粗蛋白质含量。然而,此法实际上测的不是蛋白质含量,而是通过测氮含量来推算出样品中蛋白质的含量。在凯氏定氮法中消化操作的条件是产生误差的主要原因,因此要格外注意。在实际的生产实验中,每一步应该严格按照标准的规定来进行操作。本文为笔者日常工作实验总结所得,望对实验者有些许帮助。

本文来自:化学先生
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