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丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法)
丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法)图片
包装: 100T
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产品介绍

   转氨酶是催化α -氨基酸和α -酮酸之间氨基转换反应的一组酶,丙氨酸氨基转移酶(ALT)旧称谷丙转氨酶(GPT)主要存在于肝细胞浆内,细胞内 ALT浓度远高于血清,肝细胞破坏后血清 ALT立即迅速升高,因此 ALT被世界卫生组织推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。丙氨酸氨基转移酶(ALT)检测试剂盒(赖氏比色法)其检测原理是 ALT催化丙氨酸与α -酮戊二酸之间的氨基转移反应,其反应公式如下:

          L-丙氨酸+α -酮戊二酸→丙酮酸+L-谷氨酸。

   二硝基苯肼与α -酮酸反应生成相应的二硝基苯腙,在碱性条件下二硝基苯腙的吸收光谱有差异,通过分光光度计检测在 505nm处差异最大,以等摩尔浓度计算出丙酮酸的生成量,进而计算酶的活性。100T该检测试剂盒可检测 50个样本(不含标准品),该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成:
试剂(A):丙酮酸标准22mgRT
试剂(B):丙酮酸标准稀释液5mlRT
试剂(C):标准对照液2ml4℃
试剂(D): ALT Assay Buffer30ml4℃避光
试剂(E):苯肼显色液30ml4℃避光
试剂(F): ALT显色基液250mlRT
使用说明书1份
自备材料:

1、蒸馏水

2、离心管

3、水浴锅或恒温箱

4、比色杯、分光光度计

操作步骤(仅供参考):

1、准备样品:

①血浆、血清样品:血浆、血清按照常规方法制备,可以直接用于本试剂盒的测定,-20℃保存 1个月有效,用于 ALT/GPT的检测。

②细胞或组织样品:取恰当细胞或组织进行匀浆,低速离心取上清,-20℃保存 1个月有效,用于 ALT/GPT的检测。

③(选做)样品准备完毕后可以用 BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度,以便于后续计算单位蛋白重量组织或细胞内的 ALT/GPT含量。

2、制作 ALT标准曲线:取丙酮酸标准 1支,准确加入丙酮酸标准稀释液 1ml,充分混匀,即配制成丙酮酸标准(100mmol/L),4℃保存备用。临用前,按丙酮酸标准(100mmol/L):丙酮酸标准稀释液=1:49的比例混合,即为丙酮酸标准工作液-丙酮酸标准(2mmol/L),按下表制备标准曲线,**设定平行检测管,求平均值。

加入物(ml)01234
丙酮酸标准(2mmol/L)00.020.040.060.08
标准对照液0.040.040.040.040.04
ALT Assay Buffer(37℃提前孵育 5min)0.20.180.160.140.12
相当于 ALT/GPT(卡门单位)0285797150

混匀,向各管中加入苯肼显色液 0.2ml,混匀,37℃孵育 20min,加入 ALT显色基液2ml,混匀。室温放置 5min,以蒸馏水调零,分光光度计 505nm处读取各管吸光度。各管吸光度均减去”0”号管吸光度,所得吸光度差值(纵坐标)与对应的卡门酶活力单位(横坐标)作图。

注意:标准品用分光光度计检测参考值在 0.3~0.9之间,加入 ALT显色基液后其颜色依次为黄色至棕红色,应及时检测,随着时间的延长其颜色会加深,由于检测仪器、操作手法等条件的不同,参考值范围会有波动。

3、ALT加样:按照下表设置对照管、测定管,溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的 ALT酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定。

加入物(ml)对照管测定管
待测样品(如血清等)0.040.04
ALT Assay Buffer(37℃提前孵育 5min)0.2
混匀,37℃孵育 30min。
ALT Assay Buffer(37℃提前孵育 5min)0.2
苯肼显色液0.20.2
混匀,37℃孵育 20min。
ALT显色基液22

4、 ALT测定:混匀,室温放置 5min,比色杯光径 1cm,以蒸馏水调零,分光光度计 505nm处测定对照管、测定管的吸光度(即为 A对照、A测定)。

计算:

以系列标准管活力卡门单位为横坐标,以对应的吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,以(A测定-A对照)之差值,从标准曲线查得 ALT活力卡门单位。

参考范围:

成年健康人血清 ALT:5~25卡门单位/ml

注意事项:

1、苯肼显色液溶解以后,如果仍然有结晶析出,应过滤后使用或弃用。

2、由于赖氏法的特点,在绘制标准曲线时每个点**做 3管的重复测定,求出各标准管的吸光度均值,减去“0”号管吸光度均值,对照赖氏单位绘制标准曲线。

3、血清中 ALT活性在室温可以保存 2天,4℃保存 1周,-20℃保存 1个月。

4、成批样本测定时一般无需每份样本都做自身血清对照,以试剂空白管代替即可。

5、对于超过正常范围的血清样本,应该进行复测,复测时每份样本都应做自身血清对照。

6、严重黄疸、脂血或溶血的血清,可能会引起测定管吸光度增高,因此检测该类样本时应做自身血清标本对照。

7、当样本的酶活力大于 150卡门单位时,应将样本进行 5~10倍稀释后再行测定。

有效期:6个月有效。4℃运输,4℃保存。

附录:

参考标准曲线范围:测定丙酮酸标准在 2mmol/L时,通过分光光度计测定其吸光度多在 0.3~0.9之间,加入 ALT显色基液后其颜色依次为黄色至棕红色,应及时检测,随着时间的延长其颜色会加深。测定丙酮酸标准在 0、28、57、97、150卡门单位时吸光度,据此作出其标准曲线如下:

注意:

由于检测仪器和操作手法等条件的不同,参考值范围会有波动,该值仅供参考,对于要求精确计算 ALT含量的,可以采用标准曲线进行多点重复测定;根据测定经验显示标准品浓度在 0.6mmol/L以下,1.8mmol/L以上,标准曲线会有偏差。

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