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菠萝蛋白酶检测试剂盒(福林酚微板法)
菠萝蛋白酶检测试剂盒(福林酚微板法)图片
包装: 100T
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产品介绍

菠萝蛋白酶(Bromelain)简称菠萝酶,亦称凤梨酶、凤梨酵素等,是存在于菠萝植株中的蛋白水解酶,可从菠萝果茎、叶、皮提取出来,经精制、提纯、浓缩、酶固定化、冷冻干燥而得到,菠萝蛋白酶已被广泛应用于食品、医药等行业。利用吸附力、离子键、共价键等不同的联结方式,将酶与不溶性载体联结,制成固定化酶,可以很好的避免酶的失活,易于储存运输。

菠萝蛋白酶检测试剂盒(福林酚微板法)检测原理是通过蛋白酶催化底物酪蛋白,后者水解生成酪氨酸,酪氨酸含有酚羟基,可与福林酚试剂发生福林酚反应,即福林酚试剂在碱性条件下容易定量的被酚类化合物还原,生成钨蓝和钼蓝的混合物,呈现不同深浅的蓝色。于酶标仪检测吸光度,以吸光度的大小与酪氨酸含量的多少有关,吸光度大说明酪氨酸含量高,也就是说菠萝蛋白酶分解的酪蛋白多,酶活性高。该试剂盒主要用于植物组织尤其时菠萝的匀浆液中菠萝蛋白酶活性,尤其适用于检测菠萝中菠萝蛋白酶活性。该试剂盒仅用于科研领域,不宜用于临床诊断或其他用途。

产品组成:

产品名称100T保存条件
试剂(A):组织匀浆液500ml4℃
试剂(B):Bromelain Lysis buffer500ml4℃,避光
试剂(C):Bromelain洗脱液100ml4℃
试剂(D):酪氨酸标准(10mg/ml)1ml4℃,避光
试剂(E):酪蛋白溶液10ml4℃
试剂(F):酪蛋白终止液30ml室温,避光
试剂(G):Bromelain Assay buffer20ml室温
试剂(H):福林试剂4ml4℃,避光

自备材料:

1.蒸馏水

2.研钵或匀浆器

3.离心管

4.离心机

5.酶标板

6.酶标仪

操作步骤(仅供参考):

1.准备样品:

①植物样品:取10g菠萝肉或植物组织,切碎后在研钵或匀浆器中加入等体积组织匀浆液进行研磨或匀浆,4℃静置30min,滤纸或4~6层纱布过滤,留取滤液,边搅拌边加入10ml Bromelain Lysis buffer,搅拌约10min,4℃静置1h,4℃4000r/min离心7~10min,弃上清液,收集沉淀,加入2~3倍体积的Bromelain洗脱液,搅拌洗脱20min。再次4℃4000r/min离心7~10min,取上清液,-20℃冻存,用于菠萝蛋白酶的检测。

②固定化酶:称取适量的固定化酶,溶解于0.5ml组织匀浆液,混匀,-20℃冻存待用。

③高活性样品:如果样品中含有较高活性的菠萝蛋白酶,可以使用蒸馏水或组织匀浆液进行恰当的稀释。

2.处理待测样品:取两支离心管,按下表顺序依次操作。含有测定液和对照液的离心管室温放置15min,3000r/min离心7~10min,分别取上清液待用。

单位:ml样品对照孔

待测样品(提前40℃孵育)            0.1

酪蛋白终止液(提前40℃孵育)        0.3

摇匀灭活。

酪蛋白溶液(提前40℃孵育)          0.1

混匀后40℃准确孵育10min。

单位:ml样品测定孔

待测样品(提前40℃孵育)            0.1

酪蛋白溶液(提前40℃孵育)          0.1

混匀后40℃准确孵育10min。

酪蛋白终止液(提前40℃孵育)        0.3

摇匀灭活。

3.稀释系列酪氨酸标准:取适量的酪氨酸标准(0.1mg/ml),按下表配制不同浓度的酪氨酸标准备用。

加入物质(μl)12345
酪氨酸标准(0.1mg/ml)1020304050
蒸馏水403020100
酪氨酸浓度(mg/ml)0.020.040.060.080.1

4.Bromelain加样:取96孔板,按照下表设置空白孔、标准孔、样品对照孔、样品测定孔,溶液应按照顺序依次加入,并注意避免产生气泡。如果样品中的菠萝蛋白酶活性过高,可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定,样品的检测**能设置2平行管,求平均值。

加入物质(μl)空白孔标准孔样品对照孔样品测定孔
蒸馏水35---
系列酪氨酸标准(1~5号)-35--
对照液--35-
测定液---35
Bromelain Assay buffer175175175175
福林酚试剂35353535

5.Bromelain测定:充分混匀,40℃孵育显色15min,以对照孔调零,酶标仪测定680nm处测定孔的吸光度;同时以空白孔调零,酶标仪测定680nm处系列酪氨酸标准(1~5号)孔的吸光度。

计算:

以系列酪氨酸标准(1~5号)浓度(mg/ml)为横坐标,对应的吸光度值为纵坐标,绘制酪氨酸标准曲线,通过样品测定管的吸光度,在标准曲线上查得各测定孔中酪氨酸浓度。菠萝蛋白酶活性单位的定义:在40℃pH7.0时,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为一个活性单位。其比活力定义:每毫克蛋白所含蛋白酶活力单位的数量。

菠萝蛋白酶(U)=(测定液的酪氨酸浓度×1000)/15

式中:测定管的酪氨酸浓度单位为mg/ml;1000=μg与mg的单位换算;15=孵育时间15min

注意事项:

1.待测样品中不能含有酶抑制剂,同时需避免反复冻融。

2.菠萝蛋白酶提取时,注意低温操作,防止酶活性,亦可-20℃保存。

3.如果没有酶标仪,也可以使用分光光度计测定。每次检测指标不宜过多,否则操作时间不一,有可能导致样本间的差异。

4.离心时**采用低温离心机,常温离心机也可。

5.酪蛋白终止液有一定腐蚀性,请小心操作。

6.为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期:6个月有效。4℃运输,4℃保存。

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