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异柠檬酸裂解酶(ICL)测试盒(紫外分光光度法)
异柠檬酸裂解酶(ICL)测试盒(紫外分光光度法)图片
货号: ICL-2-Y
包装: 50管/48样
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货号:ICL-2-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

ICL(EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中,油料作物种子在萌发过程中,通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理:

ICL催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和 NADH在 LDH的作用下生成乙醇和NAD,NADH在 340nm下有特征吸收峰,监测 340nm吸光度的减小速率可间接反应 ICL活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制:

提取液:液体 100ml×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 15ml×1瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 360μL×1支,4℃保存;

试剂四:粉剂×1瓶,4℃保存;

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(ml)为 500~1000:1的比例(建议 500万细菌或细胞加入 1ml提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30次);15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(ml)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1ml提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

(1)工作液的配置,将试剂二和试剂三转移至试剂一中,充分混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(2)在试剂四中加入 4ml蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(3)在微量石英比色皿或 96孔板中加入 10μL样本、150μL工作液和 40μL试剂四,混匀,立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 2min20s后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2

ICL活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=1608×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=3.215×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3216×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

ICL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=6.25×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.01 ml;V样总:加入提取液体积,1 ml;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/ml;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500万。

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