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糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒(微量法)
糖原磷酸化酶b(GPb)试剂盒(微量法)图片
货号: GPB-1-Y
包装: 50管/24样
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货号:GPB-1-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

糖原磷酸化酶(Glycogen phosphorylase,GP,EC 2.4.1.1))是糖原分解代谢的关键酶,使糖原分子从非还原端逐个断开 α-1,4-糖苷键移去葡萄糖基,释放 1-磷酸葡萄糖,直至临近糖原分子 α-1,6-糖苷键分支点前 4个葡萄糖基处。GP分为有活性的糖原磷酸化酶 a(GPa)和无活性的糖原磷酸化酶 b(GPb)两种形式。GPb在一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)存在下可被激活。

测定原理:

GP催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖,磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP还原生成 NADPH,在 340nm下测定 NADPH上升速率,即可反映 GP活性。添加一定浓度的腺苷酸(5,-AMP)时测定 GP(GPa和 GPb)活性,未添加腺苷酸(5,-AMP)时测定 GPa活性,GP活性-GPa活性得到 GPb活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:60mL×1瓶,4℃保存;

试剂一:液体 40 mL×1瓶, 4℃保存;

试剂二:粉剂×1瓶,-20℃保存;

试剂三:粉剂×1支,-20℃保存;

试剂四:粉剂×1支, -20℃保存;

试剂五:粉剂×1支, -20℃保存;

样本的前处理:

按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10的比例(建议称取约 0.1g组织,加入 1mL提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零;

2、工作液的配制:临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、试剂三的配制:临用前在试剂三瓶中加入 2.5mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

4、试剂四的配制:临用前在试剂四瓶中加入 2.5mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

5、试剂五的配制:临用前在试剂五管中加入 1.25mL蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

6、将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于 37℃预热 5分钟;

7、 1mL石英比色皿中加入 50μL样本、50μL试剂三、50μL试剂四、50μL蒸馏水和 800μL工作液,立即混匀,记录 340nm处 5min后的 A1和 10min后的吸光值  A2,计算 ΔAGPa=A2-A1。

8、在 1mL石英比色皿中加入 50μL样本、50μL试剂三、50μL试剂四、50μL试剂五和 800μL工作液,立即混匀,记录 340nm处 5min后的 A3和 10min后的吸光值 A4,计算ΔAGP=A4-A3。

注意:由于每个样本需要同时测一个 GP(GPa和 GPb)活性和一个 GPa活性,因此本试剂盒 50管测 24个样本。

GPb活性计算:

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb ( nmol/min/mg   prot ) = [(ΔAGP - ΔAGPa)×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(V样 ×Cpr)÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每 g组织每分钟产生 1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

GPb ( nmol/min/g鲜重 ) = [(ΔAGP - ΔAGPa)×V反总÷ ( ε×d ) ×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=643×(ΔAGP-ΔAGPa)÷W

V反总:反应体系总体积,1×10-3 L;ε:NADPH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.05 mL;V样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,5 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g。

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