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线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒(微量法)
线粒体苹果酸脱氢酶(MDHm)测试盒(微量法)图片
货号: MDHm-1-Y
包装: 100管/96样
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货号:MDHm-1-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

MDH (EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH是 TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH分为 NAD-依赖的 MDH和 NADP-依赖的 MDH,细菌中通常只含有 NAD-MDH,在真核细胞中,NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。

测定原理:

MDHm催化 NADH还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm处光吸收下降。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一:100mL×1瓶,-20℃保存;

试剂二:20mL×1瓶,-20℃保存;

试剂三:1.5mL×1支,-20℃保存;

试剂四、液体 20 mL×1瓶,在 4℃保存;试剂五、粉剂×1瓶,-20℃保存;

样本测定的准备:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、称取约 0.1g组织或收集 500万细胞,加入 1mL试剂一和 10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、将匀浆液于 600g,4℃离心 5min。

3、弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g,4℃离心 10min。

4、上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 MDH(此步可选做)。

5、在步骤④的沉淀中加入 200uL试剂二和 2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率 20%或200W,超声 3秒,间隔 10秒,重复 30次),用于 MDHm活性测定。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、检测工作液的配制:用时在试剂五中加入 19mL试剂四和 0.5mL蒸馏水,充分混匀待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、测定前将检测工作液在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min以上。

4、在微量石英比色皿或 96孔板中加入 5μL样本和 195μL工作液,混匀后立即记录 340nm处 20s时的吸光值 A1和 1min20s后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

MDHm活力单位的计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=6430×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T =1299×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=0.65×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,0.202mL; T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;2000:细胞或细菌总数,2000万。

b.用 96孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg组织蛋白每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(V样×Cpr)÷T=12860×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g组织每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总)÷T =2598×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol的 NADH定义为一个酶活力单位。

MDHm(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(2000×V样÷V样总)÷T=1.3×ΔA

V反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε:NADH摩尔消光系数,6.22×103 L/ mol/cm;d:96孔板光径,0.5cm;V样:加入样本体积,0.005 mL;V样总:加入提取液体积,0.202 mL; T:反应时间,1 min;W:样本质量,g;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;2000:细胞或细菌总数,2000万。

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