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外切-β-1,4-葡聚糖酶(C1)/纤维二糖水解酶测试盒(可见分光光度法)
外切-β-1,4-葡聚糖酶(C1)/纤维二糖水解酶测试盒(可见分光光度法)图片
货号: C1-2-Y
包装: 50管/24样
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货号:C1-2-Y
产品介绍

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

C1(EC3.2.1.91)存在于细菌、真菌和动物体内,是纤维素酶系的组份之一,C1催化多聚糖链的末端非还原端释放出纤维二糖和葡萄糖。

测定原理:

采用3,5-二硝基水杨酸法测定C1催化微晶纤维素降解产生的还原糖的含量。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、水浴锅、离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 15mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

样品测定的准备:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织, 加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 540nm,蒸馏水调零。

2、加样表(在 EP 管中依次加入下列试剂):

试剂名称(μL)测定管对照管
样本5050
试剂一500
蒸馏水
500

混匀,37℃准确水浴 2h

试剂二
1000
1000

混匀, 90℃水浴 10min(盖紧,防止水分散失),冷却后,测 540nm 下吸光值 A,计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。

C1 活性计算

1、标准条件下测定回归方程为 y = 6.4078x - 0.0673;x 为标准品浓度(mg/mL),y 为吸光值。

2、血清(浆)C1 活力的计算

单位的定义:每 mL 血清(浆)每分钟催化产生 1μg  葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1 活力(μg/min/mL)= [1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V 反总]÷V 样÷T=14.305×(ΔA+0.0673)

3、细胞、细菌和组织中 C1 活力的计算

(1)按照蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1μg  葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1 活力(μg/min/mg prot)=[ [1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=14.305×(ΔA+0.0673)÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1 活力(μg/min/g 鲜重)=[1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V 反总]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=14.305×(ΔA+0.0673)÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1μg 葡萄糖定义为一个酶活力单位。

C1 活力(μg/min/104 cell)=[1000×(ΔA+0.0673)÷6.4078×V 反总]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.0286×(ΔA+0.0673)

1000:1mg/mL=1000ug/mL;V 反总:反应体系总体积,0.55mL; V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,120 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

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